Diseño in silico y evaluación funcional de genes semisintéticos que confieran tolerancia a fosfinotricina

Una de las tecnologías que ha permitido mejorar la eficiencia en el control de malezas y al mismo tiempo aumentar la productividad en diversos cultivos y en diferentes países, es el uso de variedades Genéticamente Modificadas (GM) con tolerancia a herbicidas (Brookes & Barfoot, 2015). Esta metodología se basa en la introducción de genes foráneos que confieren resistencia a herbicidas no selectivos de amplio espectro, permitiendo que el agroquímico se pueda utilizar en cualquier etapa de la cosecha, sin ocasionar daños al cultivo.

El primer paso para el desarrollo de una línea GM, es la obtención de un constructo génico que exprese el gen de interés en la planta. Estos casetes de expresión se han desarrollado mediante técnicas de biología molecular convencionales, sin embargo, gracias a herramientas de bioinformática y biología sintética, es posible diseñar y probar el constructo in silico, para luego contratar su síntesis

El diseño in silico de genes semi-sintéticos, constructos genéticos o casetes de expresión, es una herramienta versátil que permite al investigador manejar fácilmente variables en la secuencia de ADN y de los constructos que con el uso de técnicas moleculares convencionales sería muy dispendioso. Esta metodología permite la libre escogencia de secuencias promotoras, terminadoras, genes, regiones no traducidas (UTR), enhancers, péptidos señal, entre otros; insertar o eliminar sitios de restricción que faciliten manipulaciones en el laboratorio y realizar modificaciones en la secuencia codificante como optimizaciones de uso codónico y remoción de secuencias indeseables, factores que mejoran significativamente los niveles de expresión genética.

Resultados y discusión

Selección de las secuencias

La fosfinotricina (PPT) es el ingrediente activo de varios herbicidas comerciales, se comporta como un inhibidor competitivo de la enzima glutamina sintetasa. La obtención de plantas transgénicas tolerantes a PTT, se ha logrado básicamente mediante la introducción de uno de dos genes: el gen bar de Streptomyces. hygroscopicus (Thompson et al., 1987) o el gen pat de S. viridochromogenes (Wohlleben et al.,1988). Estos genes codifican para la proteína fosfinotricina n-acetil transferasa (PAT); esta proteína acetila el grupo NH2 de la PPT dando lugar a la formación de N-acetil fosfinotricina, que no tiene actividad herbicida (Dröge et al., 1992). Para los constructos diseñados en este trabajo se seleccionó el gen bar, ya que hay varios reportes del uso del mismo como marcador de selección específicamente en plantas de soya (Zhang et al., 1999; Paz et al., 2004; Zeng et al., 2004; Paz et al., 2006).

Como elementos promotores de los constructos, se seleccionaron promotores de expresión constitutiva, ya que se requiere que el gen se exprese en todos los tejidos de la planta transformada. Se seleccionaron los promotores 35S (Odell et al., 1985) y FMV (Sanger et al., 1990; Maiti et al., 1997). El p35S es el promotor constitutivo más utilizado en transformación genética de plantas. Y el promotor FMV, ha sido utilizado en varios eventos de transformación genética mostrando una buena expresión del gen heterólogo (ej. MON89788, GTSB77, GT73 entre otros). Como secuencias terminadoras se utilizaron la región terminadora 35S y la secuencia terminadora del gen Rubisco E9 (rbcs, subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa) de la arveja o guisante (Pisum sativum), que ha sido utilizada en varias líneas GM comerciales.

Diseño "in silico" de genes semisintéticos

Una de las mayores ventajas del diseño in silico de casetes de expresión, es que permite realizar cambios en las secuencias nucleotídicas que pueden mejorar significativamente la expresión del gen, en el genoma que se va a introducir. Dentro de estos cambios las modificaciones de uso codónico han demostrado ser uno de los factores más influyentes para lograr buenos niveles de expresión (Perlak et al., 1991; Lannacone et al., 1997; Laguía-Becher et al., 2010; Yan et al., 2011; Kucho et al., 2013).

En este trabajo se diseñaron dos casetes de expresión. En el primero, denominado Bar-IGP se realizaron modificaciones de uso codónico sobre la secuencia codificante original (gen bar de Streptomyces hygroscopicus), con el fin de acercarlo al uso codónico de la soya. Para este constructo se utilizó el promotor FMV y el terminador E9. Se eliminaron secuencias cripticas de splicing y sitios de poliadenilación prematuros del ORF. La secuencia del gen bar es de origen bacteriano, y tiene un alto contenido de GC en el tercer codón (89 %), que es un valor más alto que el reportado para genomas vegetales (Kawabe & Miyashita, 2003). Las modificaciones de uso codónico permitieron cambiar el contenido de GC a 40 %, que es un valor más cercano al observado en el genoma de la soya (45.69 %). Se cambiaron 153 pares de bases (27.72 %) y 132 codones (71.74 %). La muestra una comparación de los parámetros mencionados entre la secuencia inicial y la secuencia final.

Para el segundo constructo (Bar-2) se utilizó la versión nativa del gen, en conjunto con el promotor y el terminador 35S. Así, los dos constructos, uno con modificaciones de uso codónico, y uno con la secuencia nativa del gen, permitirán evaluar el efecto de la optimización codónica en futuros experimentos.

La herramienta ORF Finder demostró que los casetes de expresión generan una proteína de 183 aminoácidos. Mediante alineamiento pareado con el algoritmo de Smith-Waterman se determinó un 100 % de identidad entre la proteína predicha y la proteína esperada, indicando que los constructos efectivamente codifican para la fosfinotricina acetil transferasa

Conclusiones

Se realizó el diseño in silico de constructos que confieren tolerancia a fosfinotricina. El análisis traduccional in silico, demostró que los constructos diseñados efectivamente codifican para la proteína PAT. Los explantes de N. benthamiana cocultivados con la bacteria que porta el vector BAR-IGP, mostraron una respuesta fenotípica diferencial con respecto a los explantes control, indicando que el constructo diseñado podría conferir tolerancia a la fosfinotricina. Las pruebas de PCR y RT-PCR demostraron que las plantas fueron transformadas con el gen de interés, y que el gen se transcribe a ARNm. Estos resultados son una evidencia preliminar de la funcionalidad de los constructos diseñados, indicando que la metodología utilizada para el diseño de genes permite la obtención de constructos funcionales. Una validación funcional completa, podría permitir la utilización de los constructos en experimentos de transformación genética de variedades colombianas de soya. Finalmente, los elementos de los casetes de expresión diseñados no están cubiertos por patentes en Colombia, lo que es importante, para el desarrollo de líneas GM con fines comerciales en el país.