Clonación, expresión y caracterización de una nueva esterasa derivada de metagenomas de suelos agrícolas colombianos

La bioprospección de ADN metagenómico derivado de comunidades microbianas asociadas a un agroecosistema de importancia nacional. Este análisis permitió realizar la producción, expresión, purificación y caracterización de una enzima novedosa con actividad esterasa. Esta enzima, denominada LipM, había sido previamente identificada en clones metagenómicos derivados de suelos dedicados al cultivo de papa criolla (Solanum pureja), mediante secuencia de nueva generación y análisis bioinformáticos. La secuencia codificante de la enzima fue clonada en el vector pBADgiii y expresada en E. coli como sistema de expresión, lo que permitió optimizar el proceso de producción recombinante y su posterior purificación.

La metagenómica corresponde al aislamiento y estudio del material genético total (metagenoma) asociado a un determinado ambiente natural. La importancia de la metagenómica, en comparación con la secuenciación de genomas individuales y el método tradicional de cultivo, radica en que permite analizar la información genética de la gran mayoría de microorganismos que no son cultivables en condiciones de laboratorio.

Los ensayos realizados sobre librerías metagenómicas, tanto funcionales como aquellos basados en secuencia de ácidos nucleicos y análisis bioinformáticos, permiten identificar clones bacterianos con actividades de interés. Posteriormente, los genes asociados a dichos fenotipos pueden ser caracterizados e insertados en algún hospedero, con el fin de producir de forma recombinante las respectivas enzimas o metabolitos.

El análisis bioinformático sobre insertos de ADN metagenómico provenientes de un suelo dedicado al cultivo de papa criolla (Calderón et al., manuscrito en preparación), permitió realizar la identificación de una secuencia codificante de 591 pares de bases (pb) para una enzima lipasa putativa con dominio α/β hidrolasas.

Esta enzima de 317 aminoácidos (aa), denominada LipM, mostró un peso teórico de 42 kDa y punto isoeléctrico (pI) de 5.8. El análisis de la secuencia de nucleótidos de este gen en la base de datos del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), no evidenció identidad con ninguna secuencia reportada hasta ahora. Por su parte, el análisis por BLASTp evidenció que la proteína LipM presentó una identidad de 49% en su secuencia de aminoácidos con una proteína lipasa de Mycobacterium thermoresistibile ATCC 19527 (gbEHI10768.1) y de 47 % con la lipasa/esterasa de Mycobacterium abscessus (gbEIU36003.1). La secuencia GDSAGG en esta proteína corresponde al motivo conservado GXSXG de las α/β hidrolasas (Holmquist, 2000). Según la secuencia de este dominio conservado, se sugiere que esta enzima podría pertenecer al grupo V de la clasificación de lipasas/esterasas.

Conclusiones:

En esta investigación reportamos la caracterización de la enzima LipM proveniente de un suelo de dedicación agrícola en Colombia. Esta enzima fue aislada a partir de una librería metagenómica y pertenece a la familia V de la clasificación de lipasas/esterasa. Presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil de ácidos grasos de cadena corta con un amplio rango de actividad a diferentes temperaturas y pH, teniendo mayor actividad a temperaturas entre 30 °C – 37 °C y en valores de pH cercanos al fisiológico (entre 7.0 y 8.0). Igualmente presentó buena estabilidad en presencia de varios iones metálicos y algunos inhibidores. Con 54 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVIII No. 2 Julio-Diciembre 2016 48-55 base en los resultados de actividad reportados en esta investigación, consideramos que rLipM es una enzima con potencial biotecnológico e industrial, debido a que a 65 °C esta enzima conservó alrededor del 60% de su actividad, además de incrementar de forma significativa su actividad en presencia de CaCl2. Adicionalmente, rLipM sigue siendo parcialmente estable a concentraciones de 0.1-1% (p/v) de SDS. Este estudio también demostró que el enfoque metagenómico es muy útil para ampliar el conocimiento de la diversidad de enzimas, especialmente para esterasas bacterianas. El acceso a librerías metagenómicas ambientales es una fuente inmediata de nuevos biocatalizadores o enzimas con buen rendimiento que pueden, por un lado, ser aptas para optimizar los procesos de producción al introducir por ejemplo vectores de expresión citoplasmática o extracelular como el pBADgIII y/o cultivo en sistema de bioreactor y, por otro lado, pueden también ser modificadas por ingeniería genética para cumplir determinados propósitos de la industria. Este tipo de enzimas se podrían producir y comercializar en Colombia para procesos con mercado abierto, como el de transesterificación química de compuestos altamente contaminantes, producción de biodisel o como suplemento alimenticio de animales monogástricos.