Identificación molecular con base en el gen hsp70 de aislamientos clínicos de Leishmania spp. en Colombia
La leishmaniasis es una enfermedad de gran prevalencia en Colombia, donde al menos seis especies diferentes la originan en el ser humano, con un amplio rango de características clínicas. La tipificación de la especie es importante, no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino para el diagnóstico, dado que el tratamiento puede variar dependiendo de la especie identificada. En la identificación se han utilizado varias alternativas metodológicas con diferentes niveles de poder discriminatorio.
Objetivo.
Identificar especies de Leishmania mediante la amplificación molecular de un fragmento del gen hsp70.
Materiales y métodos.
Se amplificó un fragmento del gen hsp70 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR-hsp70) y se hizo el análisis de los polimorfismos de la longitud (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) de los fragmentos de restricción de 81 aislamientos clínicos de Leishmania spp. de pacientes con leishmaniasis cutánea y mucocutánea para la identificación de las especies presentes.
Resultados.
Se obtuvo un solo amplicón para todas las muestras analizadas. La restricción enzimática de los 81 productos permitió la identificación de 70 con dos patrones de bandas que correspondían a dos alelos de Leishmania braziliensis (62 y ocho aislamientos, respectivamente), nueve aislamientos compatibles con L. panamensis y dos con L. guyanensis. El origen geográfico de los aislamientos coincidió con el de reportes previos sobre la distribución de dichas especies en Colombia.
Conclusiones.
La técnica de la PCR-hsp70 y el análisis de RFLP fueron útiles para identificar las especies de Leishmania aisladas de muestras clínicas de Colombia y pueden aplicarse también en el estudio de cepas de vectores y reservorios de importancia epidemiológica.
Obtención del ADN a partir de los
aislamientos clínicos Para la extracción del ADN se utilizó el método descrito
por Sambrook, et al. (20), a partir de los parásitos obtenidos de los
aislamientos. Cebadores para la amplificación del gen hsp70 Se utilizaron los
cebadores propuestos por García, et al. (11), los cuales amplifican un
fragmento polimórfico de 1.422 pb del gen hsp70 de Leishmania spp. y permite la
tipificación de numerosas especies de Leishmania mediante digestión enzimática
(15). Los cebadores se sintetizaron con SIGMA Genosys (Bornem, Bélgica), cuyas
secuencias (5’-3’) son la positiva para hsp70: 5´ GACGGTGCCTGCCTACTTCAA 3´ y la
negativa para hsp70: 5´ CCGCCCATGCTCTGGTACATC 3´.
El ADN obtenido de los aislamientos resultó adecuado para hacer las amplificaciones mediante PCR-hsp70. Se obtuvieron los amplicones del tamaño esperado (1,4 kpb) para todos los aislamientos clínicos de Leishmania spp. analizados provenientes de pacientes con leishmaniasis cutánea o mucocutánea. La precipitación posterior de los ácidos nucleicos permitió la restricción enzimática en todos los casos.
La discriminación entre L. panamensis y L. guyanensis usando la restricción del producto amplificado de la hsp70 con BccI, resulta muy evidente si se sigue el protocolo propuesto, el cual se evaluó previamente en cepas de referencia, aislamientos y muestras clínicas procedentes también de Colombia.
Por otra parte, L. guyanensis se identificó solo en 2,4 % de los aislamientos, todos procedentes del sudeste del país, lo que concuerda con otros estudios que reportaron esta especie en unas pocas muestras procedentes de los mismos departamentos de Guaviare y Caquetá. Sin embargo, debe tenerse en cuenta la identificación previa de L. guyanensis como agente causal de leishmaniasis cutánea en Sucre, lo que constituyó el primer reporte de su presencia en la Costa Caribe colombiana. Este hallazgo también respalda el planteamiento de un posible cambio en el patrón de transmisión de esta especie en Colombia, la cual supondría su adaptación a condiciones ecológicas diferentes a las de las zonas selváticas donde habitualmente se encuentra, y su diseminación en áreas peridomiciliares, lo que es relevante para la identificación de casos y el tratamiento.
Otras variantes de PCR-RFLP basadas en la amplificación de distintas regiones del gen hsp70 y evaluadas en diferentes contextos, resultan más sensibles y específicas para la detección e identificación de Leishmania spp. en muestras clínicas en zonas endémicas, y constituyen alternativas para la identificación individual de especies según el fragmento de gen que amplifican. Por el contrario, la tipificación de aislamientos clínicos, o de otro tipo, en los que se puede obtener gran cantidad de ADN procedente del cultivo de los parásitos, no precisa de protocolos con gran sensibilidad. En ese caso, la amplificación del fragmento de 1.422 pb del gen hsp70 utilizada en este estudio podría ser una alternativa atractiva, debido al número de especies individuales que permite identificar, y contribuir a los estudios epidemiológicos en el territorio colombiano u otras zonas endémicas que involucren cepas no caracterizadas provenientes de casos humanos, de vectores y de los posibles reservorios, para así tener una aproximación global al estudio de la leishmaniasis.
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